ToloBio王金：CRISPR-based Non-nucleic Acid Detection

2026-04-30 10:34:29

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ToloBio CRISPR 非核酸检测王金

第五期CRISPR诊断技术的创新与转化——ToloBio王金：CRISPR-based Non-nucleic Acid Detection

CRISPR-Cas 系统是原核生物的适应性免疫系统，其精准识别与高效切割特性被广泛应用于基因编辑与分子诊断。王金博士团队首次鉴定 CRISPR-Cas12 蛋白的反式切割活性，并开发 HOLMES™ CRISPR 分子诊断系统，推动了 CRISPR 诊断技术的发展。传统 CRISPR 检测以核酸为主要靶标，在病原体检测、肿瘤液体活检等领域具备临床应用潜力。

然而，临床与现场快速检测中大量关键标志物为非核酸靶标，包括蛋白质、小分子代谢物、金属离子、酶活性等，开发基于 CRISPR 的非核酸检测技术具有重要临床价值与应用前景。

王金博士，吐露港生物创始人、CEO，中国医药生物技术协会生物诊断技术分会常务委员。主要研究方向是基于CRISPR原理的“下一代分子诊断技术的开发及其应用”。首次鉴定CRISPR-Cas12蛋白的反式切割活性，并开发了名为“HOLMES/福尔摩斯”的新型CRISPR分子诊断系统。

以下为王金博士的部分报告内容：

注：报告由生物诊断平台整理汇编，内容仅供学习参考。

CRISPR 核酸检测技术原理与优势

1.1 反式切割活性

CRISPR诊断技术的核心在于特定Cas蛋白（如Cas12、Cas13）的反式切割活性（也称旁路切割活性）。在向导RNA（crRNA）的引导下，Cas蛋白能够精准识别并结合靶标核酸，形成三元复合物。该过程不仅能顺式切割靶标核酸，更重要的是能激发Cas蛋白对体系中任意单链核酸探针的非特异性、高效切割，从而释放出可检测的信号。

1.2 技术优势

与传统分子诊断技术（如qPCR）相比，基于CRISPR的诊断系统具备三大核心优势：

高特异性：Cas蛋白在crRNA引导下识别靶标，具有单碱基分辨率的特异性，能有效区分SNP。

高灵敏度：一旦被激活，一个Cas蛋白可以切割成千上万个报告探针，实现信号的指数级放大。结合靶标预扩增步骤，其灵敏度可达单分子(aM)水平，有效降低假阴性率。

操作简便：整个反应在恒温条件下进行，无需PCR仪那样精密的变温设备。这使得CRISPR技术尤其适用于家庭自测、现场快速检测（POC）等场景，仅需低成本、便携式的小型加热设备即可完成。

CRISPR 非核酸检测技术体系

2.1 技术核心逻辑

将CRISPR技术应用于非核酸靶标（如小分子、蛋白、激素等）检测时，其反式切割活性依然充当信号放大器的角色。然而，由于Cas蛋白本身只识别核酸，需通过耦联识别系统将非核酸信号转化为可调控 Cas 反式切割活性的分子事件。

CRISPR 用于非核酸检测时，除了信号放大，灵敏度高以外，还有几个优点：

1.不怕气溶胶污染：免扩增检测非核酸靶标。

2.恒温便捷：保持 CRISPR 技术现场检测优势

2.2 激活子释放策略

2.2.1 基于变构转录因子（aTF）的检测

此方法利用变构转录因子（aTF）作为分子开关。aTF能特异性结合一段DNA序列。当待检测的小分子靶标存在时，它会与aTF结合，导致aTF从DNA上解离下来，从而释放出原本被结合的核酸序列。该游离的核酸序列即可作为Activator，被CRISPR系统识别，激活Cas蛋白并产生信号。

2.2.2 基于适配体的检测

适配体（Aptamer）是能特异性结合靶标的单链DNA或RNA。在该设计中，适配体首先与Activator结合形成复合物，使其处于封闭状态。当待检测的靶标分子（如小分子、金属离子）存在时，适配体会优先与靶标结合，从而释放出游离的Activator。随后，该Activator激活CRISPR-Cas系统，切割探针并输出信号。

2.2.3 基于CRISPR-ELISA (CLISA) 的免疫检测

针对蛋白质等大分子靶标，可将CRISPR技术与传统ELISA原理结合。该方法使用捕获抗体和检测抗体（其上偶联了特定的核酸Activator）对抗原采用“三明治”双抗夹心法进行检测。当抗原存在时，检测抗体被保留，其携带的Activator将激活CRISPR反应，切割探针。相较于传统ELISA或化学发光的信号输出方式，CRISPR的信号放大能力可以显著提升免疫检测的灵敏度，具有突破现有技术瓶颈的潜力。

除了产生Activator，CRISPR系统的激活还可以在向导RNA（gRNA）和Cas蛋白本身等关键节点进行调控。

2.3 调控gRNA的生成

可通过设计特定的分子机制，使功能性gRNA的产生依赖于靶标的存在。

gRNA转录调控：利用变构转录因子（aTF）调控gRNA的转录模板。靶标存在可使aTF解离，从而允许T7 RNA聚合酶转录出具有功能的gRNA，进而激活Cas蛋白。

环状gRNA的激活：设计一个环状的、无活性的前体gRNA。当特定配体（靶标）存在时，会激活一个核酶，该核酶将环状gRNA切割成有功能的线性gRNA，从而启动CRISPR反应。

2.4 调控Cas蛋白的活性

自然界中，宿主与噬菌体的博弈提供了精妙的调控范例。研究发现，Cas蛋白的活性可被翻译后修饰（如乙酰化）所调控。

基于此原理，可构建依赖辅酶因子NAD+的检测系统。在该系统中，Cas蛋白被预先乙酰化而失活。只有当体系中存在NAD+时，去乙酰化酶（如CobB）才能被激活，进而对失活的Cas蛋白进行去乙酰化，恢复其反式切割活性并产生信号。

2.5 Split-Cas系统

吐露港基于split-Cas12a开发了一种通用的非核酸靶标检测平台，旨在实现针对任意靶标的均相、免洗检测。

核心技术：将Cas蛋白拆分为无活性的N和C两段结构域，分别融合一个能与特定靶标结合的一组蛋白结构域。

工作原理：当待测靶标（如小分子、激素）存在时，它会分别结合耦联的靶标结合结构域，进而将分裂（split）的Cas蛋白拉到一起，形成有活性的Cas蛋白，高效切割报告探针并释放信号。

应用案例：

人血药浓度监测（雷帕霉素）：利用雷帕霉素天然结合的FKBP和FRB结构域，构建的Split-Cas系统可以1-2微升指尖血为样本，在10分钟内完成检测。与质谱或化学发光法相比，该方法更快、更简便、成本更低，在200例临床样本中的符合率达到100%。
植物激素检测（脱落酸ABA）：通过更换为ABA响应的结合域，该系统同样可用于植物激素的快速检测。
细菌第二信使检测（c-di-GMP）：通过设计c-di-GMP响应的结合域，实现对该信号分子的检测。