解密探针引物原料，分子诊断世界的侦察兵

图1 NMPA已注册上市产品检测方法占比，数据来源于DataMed数据库：（https://cndatamed.com/data/biaozhun.html）

注：辅助指质控品、校准品等辅助试剂

自1985年PCR技术首次实现实验验证已过去40年。而今，PCR技术作为分子检测的基石已深入分子检测的各个领域。

标准PCR是最基本的PCR形式，用于扩增目标DNA片段，也称一代PCR，它包括变性、退火和延伸的周期性循环过程。这之后qPCR（定量PCR，二代PCR技术）、dPCR（数字PCR，三代PCR技术）开始逐步应用。

探针引物是各类PCR反应的核心原料，从一代PCR到三代PCR，再到基因测序，几乎各类分子生物学技术都离不开探针引物。探针引物的质量也直接影响了扩增效率、检测特异度及灵敏度。

引物（Primer）：

引物是一段人工合成的短链寡核苷酸（通常为单链DNA），长度约18-30个碱基，在PCR或测序反应中，通过与模板DNA的特定区域互补配对，为DNA聚合酶提供起始延伸的3'-OH末端。根据扩增方向，引物分为正向引物（Forward Primer）和反向引物（Reverse Primer），分别引导双链DNA两条链的合成延伸。

探针（Probe）：

核酸探针是放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段。探针可与目标分子杂交，用于实时荧光定量PCR（qPCR）、荧光原位杂交（FISH）、数字PCR及tNGS等技术中特异性检测或捕获靶序列。按来源及性质划分，可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。

在qPCR中，Taq DNA聚合酶的5'→3'核酸外切酶活性可水解线性探针（如TaqMan探针）的报告基团与淬灭基团间的连接，释放荧光信号，实现扩增过程的实时监测与定量。

杂交捕获探针可捕获目标区域核酸序列，其带有的生物素可与链霉亲和素磁珠结合，从而达到富集目标核酸序列的目的。目前广泛应用于二代测序的杂交捕获过程。

理想的探针引物设计应满足两点：(1) 与目标序列高效杂交；(2) 不与非目标序列杂交。这一基本原理看似简单，但随着检测靶标的增加，由于目标与非目标序列的巨大多样性，实际设计中也面临挑战。

以微生物检测为例，若想要将病原体鉴定到种水平甚至亚种水平，同属下各种间的基因组相似度往往很高，可能无法在目标基因中找到该种独有的位点进行探针引物设计；而若目标类群定义宽泛（如纲、门或属水平），则需寻找该类群内所有生物共有但其他类群缺失的位点。因此探针引物设计时需在保证对目标类群高覆盖度的同时，维持高特异性。

除此之外，灵敏度是探针引物设计中另一重要考量因素。其核心在于探针引物与目标分子的结合效率，以在低丰度目标存在时实现有效检测。然而，提升靶标杂交效率可能同时增加与非目标核酸的结合，降低特异性。

因此，实际探针引物设计时需要同时权衡检测的灵敏度、特异度及覆盖度，根据产品特点设计对应的探针引物。

以下为主要的分子检测技术探针引物使用情况。

根据我国核酸探针引物质量要求（GB/T 3479—2017），DNA探针引物产品质量评价主要涉及总量、纯度、碱基缺失率、修饰基团及相对分子质量等技术指标。其整体要求见表2。

 表2 DNA引物探针产品质量技术要求[2]

a,e， “δ”表示相对误差。  

b， 指碱基数≤40 引物纯度；当碱基数≥41，或当引物为修饰引物，或%GC≥70%，或序列中有连续 5 个 G 以上时，其纯度值与表 1 规定纯度值差值的绝对值应≤5%。  

c,d， 进行脱盐或过柱方式纯化的产品，在实验没有相关要求的情况下，可不考虑纯度。

f，探针合成宜采用 HPLC 纯化方式。

HPLC, 高效液相色谱；DSL, 脱盐；OD, 光密度；OPC, 寡核苷酸纯化柱；PAGE, 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

不同的技术指标采用不同检测方法进行测定，详见表3

表3 不同技术指标的判断方法[2]

根据IVD研究社公众号中国IVD试剂原材料供应商名录v1.0，探针引物供应商约42家。国内企业如通用生物、擎科、百力格、生工、金斯瑞等已实现部分探针引物高端替代。在此不再详述，详细名单可查看相应文章（https://mp.weixin.qq.com/s/wDhj9p7Jfpzm-MSYlbrcZQ）。

参考文献：

[1] Mathematical tools to optimize the design of oligonucleotide probes and primers

[2] 核酸引物探针质量要求。GB/T 34797—2017